В восстановлении исходной структуры днк участвуют. Учебник по биологии ярыгин ч
1. Мигрирующие генетические элементы бактерий. Транспозоны. Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы.
2. Мутация. Мутации у бактерий. Мутагены. Спонтанные мутации. Обратные мутации (реверсии).
3. Индуцированные мутации бактерий. Химический мутагенез. Радиационный мутагенез. Типы мутаций.
4. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.
5. Перенос бактериальной ДНК. Конъюгация бактерий. F-фактор бактерии.
6. Трансформация бактерий. Стадии трансформации бактерии. Картирование хромосом бакетерий.
7. Трансдукция. Неспецифическая трансдукция. Специфическая трансдукция. Абортивная трансдукция. Феномен лизогении.
8. Свойства бактерий. Ненаследуемые изменения свойств бактерий. S - колонии. R - колонии. M - колонии. D - колонии бактерий.
Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.
В клетке существуют механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру изменённой ДНК. Мутации, вызванные радиацией, химическими веществами и другими факторами, теоретически могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, если бы последняя была лишена способности к репарации ДНК . Совокупность ферментов, катализирующих коррекцию повреждений ДНК, объединяют в так называемые системы репарации, принципиально различающиеся по биохимическим механизмам «залечивания» повреждений. Известно три основных направления коррекции дефектов ДНК.
1. Непосредственная реверсия от повреждённой ДНК к исходной структуре, когда изменения в ДНК исправляются с помощью единственной ферментативной реакции. Например, удаление неправильно присоединённой метильной группы при шестом атоме кислорода гуанина с помощью метилтрансферазы; или расщепление возникшего в результате облучения тиминового димера с помощью фотолиазы (рекомбинационная репарация ).
2. «Вырезание» повреждений с последующим восстановлением исходной структуры (эксцизионная репарация).
3. Активация особых механизмов , обеспечивающих выживание при повреждениях ДНК (восстановление исходной структуры ДНК в результате рекомбинации; коррекция ошибочного спаривания оснований; трансляционный синтез на повреждённой матрице ДНК ). Эти механизмы не всегда приводят к полному восстановлению исходной структуры ДНК.
Компенсация функций, нарушенных в результате мутаций
Первичная мутация может быть компенсирована вторичной мутацией, которая произошла внутри мутировавшего гена (интрагенно) или в другом гене (экстрагенно). Изменения, которые устраняют проявления мутации, не исправляя при этом первоначального нарушения в ДНК , называют супрессией .
Интрагенная супрессия вызвана вторичной мутацией, корригирующей эффекты первичной мутации. Например, точечная мутация, приводящая к синтезу дефектного белка с утраченной биологической активностью, может быть исправлена, если вторичная точечная мутация приведёт к кодированию аминокислоты, сохраняющей конфигурацию и активность белка. Точное восстановление исходной структуры гена называют истинной обратной мутацией (истинной реверсией ). Если эффект первой мутации компенсирован мутацией в другой части гена, такие мутации называют вторичными реверсиями.
Экстрагенная супрессия - подавление проявления мутации, произошедшей в одном гене, вследствие мутации во втором гене.
РЕПАРАЦИЯ ДНК
Системы репарации
2 Эксцизионная репарация. Примеры и виды
3 Репарация ошибок репликации ДНК
4 Рекомбинантная (пострепликативная) репарация у бактерий
5 SOS-репарация
Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli.
Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная
Прямая репарация
Прямая репарация - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.
1. Так действует, например, О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза
(фермент – самоубийца), которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина
У Е. coli может в 1 мин синтезироваться до 100 молекул этого белка. Аналогичный по функциям белок высших эукариот, очевидно, играет важную роль в защите от рака, вызываемого внутренними и внешними алкилирующими факторами.
ДНК-инсертаза
2. ДНК-инсертазами
фотолиаза
3. Тиминовые димеры "расшиваются" путем прямой репарацци при участии фотолиаз , осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение . ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 - 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр.
Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др.), участвующих в фотохимической активации фермента. Фотолиаза Е. coli представляет собой белок с молекулярной массой 35 кДа, прочно связанный с олигорибонуклеотидом длиной 10-15 нуклеотидов , необходимым для активности фермента.
Примеры прямой репарации
1. Метилированное основание O 6- mG диметилируется ферментом метилтрансфераза О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (фермент – самоубийца), которая переносит метильную группу на один из своих остатков
цистеина
2. АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert- вставлять).
СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – метилированное основание O 6- mG демитилируется ферментом метилтрансферазой, который переносит метильную группу на один из своих остатков аминокислоты цистеина.
3. Фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру и после облучения этого комплекса видимым светом (300-600 нм) димер расшивается
СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – Фотолиаза
присоединяется к тиминовому димеру и после облучения видимым спектром света этот димер расшивается
Эксцизионная репарация
(от англ. excision - вырезание).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.
МЕХАНИЗМ
В эксцизионной репарации обычно принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает
не только поврежденный ,
но и соседние с ним нуклеотиды .
УСЛОВИЯ
Для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена на рис. 171.
ЭТАПЫ
Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализируют группа ДНК- N -гликозилаз - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием.
ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:
У человека ДНК- N -гликозилазы обладают высокой субстратной специфичностью: разные ферменты этого семейства распознают и вырезают различные аномальные основания (8-оксогуанин, урацил, метилпурины и др.).
У бактерий ДНК- N -гликозилазы такой субстратной специфичностью не обладает
ОБЩИЕ ФЕРМЕНТЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ
| НАЗВАНИЕ | ФУНКЦИЯ | МЕХАНИЗМ |
| ДНК- N -гликозилазы | вырезание аномальных азотистых оснований | расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием |
| АР-эндонуклеаза | создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы | разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте |
| экзонуклеаза | выщепляет несколько нуклеотидов | последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК |
КОНКРЕТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЕ ШАГИ ЭТОГО МЕХАНИЗА:
В результате действия ДНК- N -гликозилаз образуется АР-сайт, который атакуется ферментом АР-эндонуклеазой . Она разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы , которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК.
В клетках бактерий освобожденное место заполняется соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы I , ориентирующейся на вторую (комплементарную) цепь ДНК.
Поскольку ДНК-полимераза I способна удлинять З"-конец одной из цепей в месте разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5"-конца того же разрыва,
т.е. осуществлять “ник-трансляцию” , этот фермент играет ключевую роль в репарации ДНК. Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза .
В клетках эукариот (млекопитающих)
Эксцизионная репарация ДНК в клетках млекопитающих сопровождается резким всплеском активности еще одного фермента – поли А D Р-рибозо-полимеразы . При этом происходит ADP-рибозилирование белков хроматина (гистонов и негистоновых белков), что ведет к ослаблению их связи с ДНК и открывает доступ ферментам репарации.
Донором ADP-рибозы в этих реакциях выступает NAD+ , запасы которого сильно истощаются при эксцизионной репарации повреждений, вызываемых рентгеновским облучением:
Отрицательно заряженные остатки ADP-рибозы из внутреннего состава молекулы NAD+ присоединяются через радикал глутаминовой кислоты или фосфосерина к белкам хроматина, что ведет к нейтрализации положительных зарядов этих белков и ослаблению их контакта с ДНК.
ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ГРУППА ФЕРМЕНТОВ
ДНК – гликозилазы
расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием
что приводит к вырезанию аномальных азотистых оснований
ДНК - гликозилазы , участвующие в устранении окислительных повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот , весьма разнообразны и отличаются по субстратной специфичности, пространственной структуре и способам взаимодействия с ДНК.
К наиболее изученным ДНК-гликозилазам относятся:
эндонуклеаза III (EndoIII),
форм амидо пиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg),
Mut T и
Mut Y кишечной палочки.
Эндонуклеаза III Е. coli "узнает" и специфически выщепляет из ДНК окисленные пиримидиновые основания.
Этот фермент представляет собой мономерный глобулярный белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (мол. масса 23,4 кДа). Ген, кодирующий Endo III, секвенирован, установлена его нуклеотидная последовательность. Endo III представляет собой железосерный белок [(4 Fe -4 S )2+-белок], обладающий элементом надвторичной структуры типа "греческий ключ" (спираль - шпилька - спираль), служащим для связывания с ДНК . Ферменты с аналогичной субстратной специфичностью и сходной аминокислотной последовательностью выделены также из клеток быка и человека .
Форм амидо пиридин-ДНК-гликозилаза Е. coli "узнает" и выщепляет из ДНК окисленные гетероциклические основания пуринового ряда .
СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ СТАДИЯ 1
ДНК N
СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ
1 ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание
АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК
2 Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов
3 ДНК полимераза заполняет освободившийся участок комплементарными
Мононуклеотидами
ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК
Mut T - небольшой белок с молекулярной массой 15 кДа, обладающий нуклеозидтрифосфатазной активностью, который преимущественно гидролизует dGTP до dGMP и пирофосфата.
Биологическая роль Mut T заключается в предотвращении образования во время репликации неканонических пар А:G и А: 8-oxo-G .
Такие пары могут появляться в том случае, когда окисленная форма
dGTP (8-oxo-dGTP) становится субстратом ДНК-полимеразы.
Mut T гидролизует 8-oxo-dGTP в 10 раз быстрее, чем dGTP.
Это делает 8-oxo-dGTP наиболее предпочтительным субстратом Mut T и объясняет его функциональную роль.
Mut Y представляет собой специфическую аденин-ДНК-гликозилазу, расщепляющую N-гликозидную связь между аденином и дезоксирибозой аденозина, образующего неканоническую пару с гуанином.
Функциональная роль этого фермента заключается в предотвращении мутации
T:A - G:A путем отщепления неповрежденного остатка аденина из пары оснований A: 8-oxo-G.
Нуклеотидная эксцизионная репарация
(АТФ-зависимый механизм удаления повреждений из ДНК)
В последнее время в эксцизионной репарации особое внимание уделяют АТР-зависимому механизму удаления повреждений из ДНК. Этот вид эксцизионной репарации получил название нуклеотидная эксцизионная репарация (nucleotide excision repair; NER).
Она включает в себя ДВА ЭТАПА :
1. удаление из ДНК олигонуклеотидных фрагментов , содержащих повреждение, и
Эксинуклеаза
2. последующую реконструкцию цепи ДНК с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и др.).
Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и эукариот.
Удаление фрагмента ДНК у прокариот
Так, у Е. coli, В. subtilus, Micrococcus luteus вырезается фрагмент длиной 12-13 нуклеотидов,
Удаление фрагмента ДНК у эукариот
а у дрожжей, земноводных и человека - фрагмент, состоящий из 24-32 нуклеотидов.
Эксинуклеаза – фермент, удаляющий фрагменты ДНК
Выщепление фрагмента ДНК осуществляется ферментом эксинуклеазой (excinuclease). У Е. coli этот фермент состоит из 3 различных протомеров –
uvrA
uvr В
uvr С
каждый из которых выполняет определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК. Название этих белков дано по первым буквам слов "ultra violet repair".
Протомер uvr А обладает АТРазной активностью, связывается с ДНК в виде димера, осуществляя
первичное распознавание повреждения и
связывание uvr В
Протомер uvr В обладает:
1 . Латентной АТР-азной и латентной хеликазной активностью, необходимой для изменения конформаций и расплетания двойной спирали ДНК;
2. Эндонуклеазной активностью, расщепляя межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь со стороны З"-конца выщепляемого фрагмента.
Протомер uvr С действует как эндонуклеаза , вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5"-конца вырезаемого фрагмента.
Таким образом, протомеры uvr A, uvr В, uvr С взаимодействуют с ДНК в определенной последовательности, осуществляя АТР-зависимую реакцию выщепления олигонуклеотидного фрагмента из репарируемой цепи ДНК.
Образовавшаяся брешь в молекуле ДНК реставрируется при участии ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. Модель эксцизионной репарации с участием вышеперечисленных ферментов представлена на рис. 172.
Эксцизионные репарации у человека
Эксцизионные репарации у человека также имеют АТФ - зависимый характер и включают три основных этапа :
узнавание повреждения,
двойное разрезание цепи ДНК,
восстановительный синтез и
лигирование репарируемой цепи.
Однако, в эксцизионной репарации ДНК человека принимают участие
25 различных полипептидов ,
16 из которых участвуют в выщеплении олигонуклеотидного фрагмента, являясь протомерами эксинуклеазы ,
а остальные 9 осуществляют синтез репарируемого участка молекулы.
В репарационной системе ДНК у человека весьма существенную роль выполняют белки транскрипции –
РНК-полимераза II и
TF ПН - один из шести основных факторов транскрипции эукариот .
Следует отметить, что эксцизионная репарация у прокариот, как и у эукариот, зависит от функционального состояния ДНК:
транскрибируемая ДНК репарируется быстрее,
чем транскрипционно неактивная.
Этот феномен объясняется следующими факторами:
структурой хроматина,
гомологией цепей транскрибируемых участков ДНК,
эффектом повреждения цепей и его влиянием на РНК-полимеразу.
ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:
КОДИРУЮШАЯ ЦЕПЬ ДНК (цепь хранения информации)
МАТРИЧНАЯ ЦЕПЬ ДНК (с неё происходит списывание информации)
Известно, что такие крупные повреждения, как образование тиминовых димеров , блокируют транскрипцию как у бактерий, так и у человека, если они происходят на матричной цепи ДНК (повреждения на кодирующей цепи не влияют на транскрипционный комплекс). РНК-полимераза останавливается в месте повреждения ДНК и блокирует работу транскрипционного комплекса.
Транскрипционно-репарационный фактор сцепления (TRCF) .
У Е. coli усиление репарации при транскрипции опосредуется одним специальным белком - транскрипционно-репарационным фактором сцепления (TRCF) .
Этот белок способствует :
1. отсоединению РНК-полимеразы от ДНК
2. одновременно стимулирует образование комплекса белков,
Осуществляющих репарацию поврежденного участка.
По окончании репарации РНК-полимераза встает на место и транскрипция продолжается (см. рис.).
Итак общая схема эксцизионной репарации
1. ДНК- N -гликозилаза удаляет поврежденное основание
2. АР –эндонуклеаза вносит разрыв в цепь ДНК
3. Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов
4. ДНК-полимераза заполняет освободившийся участок
Комплементарными нуклеотидами
5. ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК
Репарация ошибок репликации ДНК
путем метилирования
Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды - мисмэтчи (англ. mismatch н е соответствовать ).
Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов иногда оказываются недостаточны , и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары.
В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК . Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию.
У Е. coli метилируется в основном аденин с образованием
N6-мeтил-аденина (N6-mA).
До этого момента вновь синтезированная (дочерняя) цепь остается неметилированной.
Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации: Таким образом метилирование метит ДНК и
включает систему исправления ошибок репликации.
В этой системе репарации узнаются особые структуры:
последовательность G-N6-mA-T-С и следующая за ней деформация
в двойной спирали в месте отсутствия комплементарности (рис. ниже).
В устранении неспаренных нуклеотидов в полуметилированной молекуле ДНК принимает участие достаточно сложный комплекс ферментов репарации, который сканирует поверхность молекулы ДНК, вырезает участок дочерней цепи , прибегающей к мисмэтчам , а затем создает условия для застраивания
его нужными (комплементарными) нуклеотидами.
Различные компоненты этого комплекса обладают разными активностями нуклеазной,
хеликазной,
АТРазной,
необходимыми для внесения разрывов в ДНК и выщепления нуклеотидов, расплетания двойной спирали ДНК и энергетического обеспечения движения комплекса вдоль репарируемой части молекулы.
Сходный по структуре и функциям комплекс ферментов репарации выявлен и у человека.
Рекомбинантная (пострепликативная) репарация
В тех случаях, когда по тем или иным причинам вышерассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда весьма существенные размеры , что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток.
В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую полученную после репликации молекулу ДНК, т. е. привлечь для этой цели механизм рекомбинации .
У бактерий
У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А . Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК .
В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными участками ДНК, что открывает возможность репарации путем вышеохарактеризованных систем.
При этом могут происходить вырезание определенного фрагмента и
заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи.
Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы .
SOS-репарация
Существование этой системы впервые постулировал М. Радман в 1974 г. Он же дал название этому механизму, включив в него международный сигнал бедствия "SOS" (спасите наши души).
И действительно, эта система включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки . В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.
Включение тех или иных генов, определяемых количеством повреждений в ДНК, приводит к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления).
Наиболее изучена SOS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами Rec A и Lex А .
Первый из них представляет собой полифункциональный белок Rec A , участвующий
в рекомбинации ДНК , а также
в регуляции транскрипции генов фага лямбда , поражающего Е. coli,
а второй (белок Lex А) является репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется.
Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации .
В свою очередь, индукция SOS-системы бактерии служит для фага лямбда сигналом опасности и приводит к тому, что профаг переключается с пассивного на активный (литический) путь существования, вызывая тем самым гибель клетки-хозяина .
SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных, и человека.
Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК
| Гены | Последствия активации гена |
| uvr А, В, С, D | Репарация повреждений вторичной структуры ДНК |
| Rec А | Пострепликативная репарация, индукции SOS-системы |
| lex А | Выключение SOS-системы |
| rec N, ruv | Репарация двунитевых разрывов |
| Обеспечение рекомбинационной репарации |
|
| umu С, D | Мутагенез, вызванный изменениями свойств ДНК-полимеразы |
| sul А | Подавление клеточного деления |
Заключение
Исправление повреждений в ДНК тесным образом связано с другими фундаментальными молекулярно-генетическими процессами: репликацией, транскрипцией и рекомбинацией. Все эти процессы оказываются переплетенными в общую систему взаимодействий, обслуживаемую большим числом разнообразных белков, многие из которых являются полифункциональными молекулами, задействованными в контроле реализации генетической информации в клетках про- и эукариот. В то же время очевидно, что природа "не скупится" на элементах контроля, создавая сложнейшие системы коррекции тех повреждений в ДНК, которые несут опасность для организма и особенно для его потомства. С другой стороны, в тех случаях, когда репарационных возможностей недостаточно для сохранения генетического статуса организма, наступает необходимость в программируемой клеточной смерти – апоптозе. .
СХЕМА НУКЛЕОТИДНОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ У E . COLI С УЧАСТИЕМ ЭКСИНУКЛЕАЗЫ
1. ТРАНСКРИПЦИОННО НЕЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ
2. ТРАНСКРИПЦИОННО ЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ
3. ОБЩИЙ ЭТАП РЕПАРАЦИИ
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
А - белок uvr А
Б - белок uvr В
С - белок uvr С
маленький черный треугольник – знак указывает на место повреждений
СХЕМА РЕПАРАЦИИ, СВЯЗАННАЯ С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ДНК
© Шарова Н.П., Абрамова Е.Б.
Повреждение
и починка ДНК,
или
“На всякую прореху найдется заплата”
Н.П.Шарова, Е.Б.Абрамова
Наталья Петровна Шарова,
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН.
Елена Борисовна Абрамова,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник того же института.
Записанная в ДНК генетическая программа любого живого существа - от простейшего одноклеточного до высокоорганизованного многоклеточного - сохраняется в череде потомков благодаря точному воспроизведению нуклеотидной последовательности в каждом поколении. Но если в главной наследственной молекуле возникают повреждения, а это случается даже спонтанно, изменения в ее структуре могут привести не только к разным патологиям тканей или органов, но и к передаче мутации потомству. И, как это ни удивительно, ДНК - единственная клеточная макромолекула, способная исправлять повреждения в собственной структуре. В ней даже закодирована информация о механизмах тех процессов, которые занимаются таким ремонтом (в строго научной среде их называют репарационными). Именно “починка” ДНК обеспечивает запас прочности организма.
Восстановление структуры ДНК особенно важно при формировании репродуктивных (половых) клеток и в эмбриональном развитии: во время активного синтеза новых цепей риск появления и повторения ошибок многократно увеличивается. Наследственная молекула должна залечиваться очень быстро, и делящиеся эмбриональные клетки “знают”, как это осуществить. Устраняются разные повреждения ДНК и в течение всей жизни организма. Начнем рассказ с известных к настоящему времени типов повреждений, чтобы затем рассмотреть механизмы починки, потому что от характера неисправности зависит, каким способом она будет ликвидирована.
Что может испортиться в ДНК
Поломки возможны в любом из образующих ДНК компонентов - и в азотистых основаниях, и в сахарофосфатном остове, причем как при копировании (репликации), так и при считывании (транскрипции) информации для последующего синтеза клеточных белков.
Часто случаются апуринизация того или иного нуклеотида и дезаминирование оснований. В первом случае рвутся гликозидные связи между пурином (аденином или гуанином) и дезоксирибозой, в результате чего эти основания выщепляются из цепи ДНК (место, в котором произошло такое событие, называют АП-сайтом). Второй случай - дезаминирование - приводит к образованию несвойственных для структуры ДНК соединений: вместо цитозина, аденина или гуанина появляются урацил, гипоксантин или ксантин, соответственно. Оба процесса спонтанные. За сутки в клетке человека апуринизация повторяется 5-10 тыс. раз, а частота дезаминирования составляет примерно 100 событий на полный геном.
Действие ультрафиолетового облучения приводит к насыщению двойных связей
пиримидиновых оснований и образованию димеров из двух соседних пиримидинов
в одной цепи ДНК. Ионизирующая радиация может вызвать несколько повреждений:
разрыв пуринового кольца, фрагментацию основания, окисление апуринового
сайта, а также одно- и двухцепочечные разрывы (это фактически разлом хромосом
- главная причина летального действия ионизирующей радиации). Некоторые
химические агенты способны сшивать цепи ДНК. Активные формы кислорода (ОН·,
О 2 ·–
, Н 2
О 2
,
перекиси липидов и др.), постоянно генерируемые в процессах метаболизма,
повреждают и основания, и дезоксирибозу, что способствует образованию новых
ковалентных связей. Особенно подвержены окислительному действию соседствующие
гуанины (GG). Это буквально “горячие точки” такого процесса, а его конечный
результат - модифицированное производное гуанозина. Сахарофосфатные связи
разрушаются в тех случаях, когда обе нити ДНК лишились пуринов в противолежащих
друг другу местах или вблизи произошла фрагментация дезоксирибозы. Тогда
рвутся сразу обе цепи ДНК. Источником структурных дефектов может быть и
естественный процесс - репликация, если в комплементарных цепях появляются
неспаренные нуклеотиды.
|
Клетка способна устранить перечисленные повреждения, несмотря на их различия, и восстановить структуру ДНК. Вполне понятно, что для этого требуются специальные механизмы. И хотя в частностях они отличаются один от другого и бывают весьма сложными, все же подчиняются общим принципам. Сначала опознается вид возникшей неисправности. Этим занимаются один белок или несколько (тогда они объединяются в месте изъяна в комплекс). Затем поврежденный участок вырезается в ходе ферментативных реакций, после чего ДНК-полимераза синтезирует правильный кусок ДНК. Завершается репарация сшиванием отдельных фрагментов цепи ДНК-лигазой. Такова общая схема, но каждый тип ремонта осуществляют собственные белки и ферменты, определяющие его индивидуальность. Не правда ли, эта схема напоминает обычное латание дыр на одежде?
Молекулярные ножницы и заплатки
Большая часть структурных нарушений в ДНК устраняется вырезанием (этот
тип репарации специалисты называют эксцизионной; по-англ. excision repair
),
которое осуществляют ферменты нуклеазы. Бракованное основание удаляется
в одиночку или вместе с окружением - участками цепи в 2-10 нуклеотидов.
Так вырезаются модифицированные и поврежденные основания, апуриновые сайты
и места с одноцепочечными разрывами. (Данная разновидность названа эксцизионной
репарацией основания; base excision repair,
BER.) В случае более
крупных неисправностей - возникновения пиримидиновых димеров или других
объемных образований в ДНК, нарушающих структуру спирали, - клеточные ножницы
отстригают испорченную часть в составе куска длиной в 30 нуклеотидов. (Это
уже эксцизионная репарация нуклеотида, nucleotide excision repair,
NER.)
Каков будет размер вырезаемого куска, а значит, и заплаты, зависит от самого повреждения и соотношения имеющихся в клетке ДНК-полимераз. Эти ферменты застраивают бреши, образовавшиеся после вырезания аномального участка, используя в качестве матрицы фрагмент противоположной цепи ДНК. ДНК-полимеразы (у эукариот их известно более 15) различаются по ряду признаков, в том числе по количеству нуклеотидов, которые они успевают встроить в растущую цепь за один акт связывания с дуплексом ДНК. Полимеразы b и l присоединяют всего один нуклеотид, т.е. накладывают маленькую заплатку (short patch путь BER, как говорят специалисты). Две другие ДНК-полимеразы - d и e - способны создать большую вставку, но для этого им нужен специальный помощник - белок PCNA (proliferating cell nuclear antigen ). Особенно зависим от него первый фермент - без помощника он “отваливается” от ДНК, встроив лишь один нуклеотид, а если PCNA удерживает на ней полимеразу d , то синтез идет до тех пор, пока фрагмент не достигнет нужной длины. Если в клетке не хватает той или иной ДНК-полимеразы, репарация может переключиться с одного пути на другой, т.е. с малой заплаты на большую (long patch путь BER). Клеточные линии фибробластов мышиных эмбрионов восстанавливают нормальную структуру на месте апуринизации преимущественно посредством малой заплатки (в 80% событий), а если в клетках поврежден ген ДНК-полимеразы b , починка проходит исключительно наложением большой заплаты. Кстати, способ латания дыр клеткой зависит и от того, сколько в ней содержится белка PCNA.
Мелкие неполадки. Если в ДНК изменено одно основание, его распознают, а потом вырезают N-гликозилазы, и в результате в цепи остается дезоксирибозофосфат (как при апуринизации). Далее сахарофосфатный остов надрезается АП-эндонуклеазой (класса II) с 5ў -стороны от этого промежуточного продукта, похожего на АП-сайт. Совсем удалить его клетка может двумя способами (short patch или long patch BER): вырезав только сам остаток дезоксирибозофосфата или вместе с окружающими двумя-десятью нуклеотидами. По размеру образовавшейся дырки синтезируется и заплата. Брешь в один нуклеотид застраивается ДНК-полимеразой b . Иное дело, если появившийся в ДНК АП-сайт еще и подвергся окислению или восстановлению. Такую структурную аномалию вместе с окружающими нуклеотидами вырезает другой фермент - нуклеаза FEN1, - а образовавшуюся брешь застраивают ДНК-полимеразы d или e , которые работают только с помощником - белком PCNA. Иногда короткие пробелы (длиной до 5-6 нуклеотидов) заполняют ДНК-полимеразы b или l . Помощник им не нужен, так как они сами могут временно “заякориться” на свободном 5ў -конце цепи, прилежащем к бреши, и задержаться на какое-то время на ДНК, чтобы осуществить ресинтез вырезанного участка.
Мы несколько лет занимаемся исследованием репарации у костистых рыб в период их эмбрионального развития. В этот период онтогенеза активно синтезируются новые цепи ДНК, и потому риск появления и повторения ошибок многократно увеличивается. Чтобы не произошло подобного, наследственная молекула должна очень быстро залечиваться. Сначала мы предположили, что делящиеся эмбриональные клетки должны иметь несколько равноценных способов устранения одного и того же повреждения. Таким способом одновременно восстанавливалась бы структура ДНК на всех поврежденных участках, и процесс успешно завершался бы даже в том случае, если другие пути репарации подавлены по какой-либо причине. Но вместо того, чтобы экспериментально подтвердить свое предположение, мы обнаружили неизвестный ранее вид репарации ДНК. Работая с эмбрионами и яйцеклетками вьюна (костистой рыбы), мы неожиданно столкнулись с самостоятельной застройкой довольно крупных брешей (до 10-13 нуклеотидов) ДНК-полимеразой d - тем самым ферментом, который, как только что упоминалось, не может обходиться без помощника PCNA. Но в эмбриональном периоде вьюна полимераза d в помощнике не нуждалась. Оказалось, что этот фермент способен связываться одновременно с обоими концами разорванной ДНК и прочно удерживаться там, пока не “залатает дырку” полностью. Этот механизм репарации ДНК в эмбриональных активно делящихся клетках ранее не был известен. Между тем он очень важен, особенно если учесть, что большой заплатой устраняется основное число возникших в ДНК дефектов. Открытый нами способ репарации уникален тем, что действует в экстремальных условиях: совсем без белка-помощника или при его незначительном количестве, а также в том случае, когда в клетке не хватает других ДНК-полимераз, которые обходятся без PCNA.
Не дырка, а затяжка. Ультрафиолетовые лучи вызывают ковалентное сшивание соседних пиримидинов (например, тиминов) в молекуле ДНК. В распознавании и вырезании образовавшихся циклобутановых димеров участвуют семь белков - продуктов генов семейства ХР (XPA-XPG). У человека мутации хотя бы в одном из них могут привести к возникновению наследственного заболевания - пигментной ксеродермы (xeroderma pigmentosum, ХР), которая проявляется в первые годы жизни ребенка. На не защищенных от солнечных лучей участках кожи появляются пигментные пятна и в конце концов может развиться рак кожи.
Зачем нужно так много белков, и как они действуют? Каждый из них играет
строго определенную роль. Белок ХРА узнает пиримидиновый димер в ДНК и
связывается с другими членами семейства. ХРВ и XPD входят в состав сложного
белкового комплекса - фактора транскрипции IIH (TFIIH), который расплетает
ДНК в участке, подлежащем вырезанию. Еще один белок - ХРС - удерживает
этот комплекс на поврежденном участке ДНК, а два последних (их называют
нуклеазами вырезания) - XPF и XPG - работают как ножницы. Первая нуклеаза
разрезает 24-ю фосфодиэфирную связь с 5ў
-стороны
от димера, а вторая - 5-ю связь с 3ў
-стороны.
В результате их совместного действия образуется разрыв длиной примерно
в 30 нуклеотидов .
Заделывают такую большую брешь ДНК-полимеразы d или e , но им нужен помощник PCNA. Более того, для работы первого фермента необходим еще один белок - репликативный фактор С (RFC). В присутствии АТФ он связывается с концом цепи ДНК, который подходит к бреши с 5ў -стороны, затем присоединяется PCNA и образуется нестабильный тройной комплекс. После гидролиза АТФ конформация репликативного фактора меняется так, чтобы удерживать PCNA будто раскрытыми пальцами. Сам же этот помощник за счет временного размыкания своей кольцевой формы насаживается на дуплекс ДНК. К образовавшемуся стабильному комплексу присоединяется ДНК-полимераза d , которая и застраивает большую брешь. Сходным образом работает комплекс с участием ДНК-полимеразы e . Как видно, в устранении объемных повреждений участников много, да и сам процесс довольно сложен.
Если в клетках гены активно транскрибируются (т.е. синтезируется матричная РНК), восстановление по типу вырезания нуклеотида протекает намного быстрее благодаря включению в процесс еще двух белков - CSA и CSB. У человека мутации в генах этих белков вызывают наследственное заболевание - синдром Кокэйна (Cockayne’s syndrom, CS), при котором замедляется рост, повышается фоточувствительность, возникают катаракта, кариес зубов и дерматозы. Если во время транскрипции осуществляющая ее РНК-полимераза II наталкивается на повреждение в ДНК, то связывается с белками CSA и CSB. Тогда быстрая доставка ферментов репарации к месту поломки гарантирована, они залатают прореху, после чего транскрипция может завершиться.
Ткацкие ошибки. Ошибки репликации и рекомбинация (обмен участками) между аллелями могут привести к появлению неспаренных нуклеотидов в цепи ДНК. Для устранения таких неполадок существует особый тип репарации - исправление ошибок спаривания (mismatch repair, MMR). Самый простой путь их коррекции - немедленно удалить неправильно встроенный нуклеотид с помощью все тех же ДНК-полимераз d или e (правда, с дополнительной - экзонуклеазной - активностью). Более сложный вариант осуществляют, совместно действуя, ферменты, которые способны вырезать поврежденный участок (ферменты эксцизионной репарации), и группа дополнительных белков. Они узнают одиночный неспаренный нуклеотид или петли длиной до четырех нуклеотидов. (Мутации генов этих белков у человека вызывают предрасположенность к раковым заболеваниям.) Как только дефект обнаружен, нуклеазы удаляют его вместе с 50-500 нуклеотидами с каждой стороны . Огромную брешь застраивают те же полимеразы, зависимые от PCNA и потому способные синтезировать длинные фрагменты ДНК.
Регуляция. PCNA (о нем уже шла речь как о помощнике в репарации) и белок 53 (р53) - главные регуляторы в клетке, ответственные за ее судьбу. Первый белок, PCNA, участвует в репликации, второй - р53 - в транскрипции. А что делают эти белки, если во время копирования ДНК возникло повреждение, устранить которое должна ДНК-полимераза d ? Белок 53 стимулирует синтез белка 21, а тот тормозит копирование ДНК и прохождение клеточного цикла. За время остановки репликации клетка успевает избавиться от дефекта. Как такое может быть, ведь репликация и репарация - это всегда синтез ДНК, в котором задействован один и тот же белок PCNA? Репликация останавливается из-за того, что р21 связывается с PCNA, значит, на репарацию его не будет хватать. Но нет: в области повреждения создается избыток PCNA, и оно успешно ликвидируется.
Некоторые ученые полагают, что при повышенном содержании р21 ресинтез ведет не полимераза d , а полимераза b , которая не чувствительна к действию р21. Мы же, исходя из наших результатов, предполагаем, что смены ферментов не происходит, а просто ДНК-полимераза d переключается с зависимого от PCNA заполнения брешей на независимый от этого белка синтез ДНК .
Когда структура ДНК восстановлена, ряд белков-регуляторов и ферментов, участвовавших в репарации, подвергаются гидролизу, который осуществляет 26S протеасома . К таким белкам относится, например, белок XPC. Кроме того, сама протеасома или входящий в ее состав регуляторный комплекс 19S могут играть роль молекулярных шаперонов, способствуя приобретению репаративными белками нужной конформации. В этом случае протеасома стимулирует коррекцию ДНК.
Сквозные разрывы
Сквозные разрывы в молекуле ДНК - это результат ионизирующего облучения,
окисления или механического повреждения. Такие же поломки возможны в тех
случаях, когда во время репликации на пути ДНК-полимераз встречается разрыв
в одной цепи. Но двухцепочечные разрывы могут быть и промежуточными продуктами
нормальных биологических процессов (например, рекомбинации в развивающихся
лимфоидных клетках). Если клетка не может заштопать сквозные разрывы, это
приведет к дестабилизации генома, мутациям и возникновению раковых опухолей,
а иногда к запуску апоптоза (запрограммированной гибели клетки). У эукариот
существует два основных способа устранить двухцепочечные разрывы: гомологичная
рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение негомологичных концов.
 |
 |
Последовательность реконструкции ДНК, в которой разорваны обе цепи, способом гомологичной рекомбинации (слева ) и соединением негомологичных концов.Если имеется гомологичный дуплекс ДНК, последовательность которого комплементарна хотя бы одному разорванному концу, возможна рекомбинационная репарация. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae это основной вариант, и зависит он от белка RAD52, а в случае мутаций гена Rad52 соединяются негомологичные концы, т.е. включается второй вариант репарации. У млекопитающих, напротив, второй способ главным образом и работает, а у дрозофилы оба пути равнозначны . Независимо от варианта репарации фрагменты разной длины просто вырезаются, последующее их восстановление не предусмотрено. Естественно, при этом нарушается первичная структура ДНК и теряется закодированная в удаленных участках информация. Но поскольку двухцепочечные разрывы сравнительно редки, клетке, по всей видимости, выгоднее пойти на такие жертвы, чем оставить ДНК разорванной.
Первый способ восстановления ДНК характерен для дрожжей (Saccharomyces cerevisiae ), второй - для млекопитающих, в том числе для человека.
Объяснения в тексте.
Гомологичный обмен. Белок RAD52, от которого зависит рекомбинационная репарация у дрожжей, связывается, как только что упоминалось, с выступающими концами разорванных цепей ДНК, чем защищает их от действия экзонуклеаз. Затем RAD52 стимулирует присоединение белка RAD51 к тем местам, где находился сам. После этого один конец или оба внедряются в гомологичный дуплекс ДНК и происходит рекомбинация. Выступавшие из “прорехи” части ДНК вырезаются, и образовавшаяся брешь застраивается сразу с противоположных сторон, т.е. синтез фрагментов идет навстречу друг другу. В клетках дрожжей S.cerevisiae его осуществляют полимеразы d и e , которые нуждаются в PCNA и репликативном факторе (RFC), чтобы удержаться на оборванном конце ДНК и вести синтез. Правда, в застраивании бреши участвует еще и ДНК-полимераза a , единственная из многочисленных полимераз, способная инициировать синтез ДНК в репликативной вилке - там, где начинают расплетаться нити. Учитывая участие этого фермента в репарации сквозных разрывов ДНК, А.Холмс и Дж.Хэйбер предложили модель, по которой внедрение одного из разорванных концов в гомологичный дуплекс ДНК создает необычную репликативную вилку, где и синтезируются цепи . Репликация завершается, когда второй конец достигает разрыва. Оказавшийся лишним “повисший” концевой участок второй цепи удаляется нуклеазой.
С гомологичной рекомбинацией связан еще один способ латания мест разлома. Разорванные концы ДНК по кусочку отрезаются специфической экзонуклеазой в обоих направлениях от разрыва до тех пор, пока не откроются комплементарные последовательности. Затем следует отжиг (спаривание) комплементарных участков и подрезание “висящих” негомологичных хвостов ДНК. Этот путь репарации также зависит от белка RAD52.
Соединение негомологичных концов. Починка этим способом ДНК, разорванной в обеих цепях, обеспечивается целым набором белков. Это белок Ku и комплекс, образованный ДНК-лигазой IV и продуктом гена XRCC4 . Все они консервативны у эукариот, включая дрожжи и млекопитающих. Несмотря на то, что в ходе репарации порванные концы соединяются напрямую, без использования матрицы для синтеза, процесс должен быть максимально аккуратным и точным. Для выполнения этого требования служит белок Ku, который представляет собой гетеродимер из субъединиц Ku70 и Ku80 (молекулярная масса 70 и 80 кДа соответственно). Недавно была исследована кристаллическая структура человеческого гетеродимера, а также структура его комплекса с фрагментом ДНК в 55 нуклеотидов. Оказалось, что гетеродимер Ku кольцом обвивается вокруг дуплекса ДНК, но при этом не контактирует с основаниями ДНК, а образует несколько связей с сахарофосфатным остовом и подгоняется пространственно к виткам спирали ДНК так, чтобы они расположились в кольце белка строго определенным образом. Такая конфигурация комплекса Ku и ДНК, очевидно, необходима для поддержания той структуры выступающих оборванных концов, которая пригодна для следующих этапов репарации.
А их несколько. Сначала на оборванные концы ДНК “надевается” по гетеродимеру, затем они связываются друг с другом, образуя мостик. Именно к нему присоединяются и выполняют свои функции остальные участники: ДНК-полимераза заполняет бреши, образовавшиеся в результате соединения негомологичных концов ДНК; нуклеаза подрезает выступающие концы, если они оказались излишне длинными; лигаза IV сшивает восстановленные фрагменты в единое целое. У некоторых эукариот обнаружена ДНК-полимераза m, которая, видимо, и заполняет бреши в ДНК.
Когда сшиты цепи
Некоторые химические агенты, например, лекарства против рака (цисплатин, митомицин, псорален), вызывают образование межцепочечных сшивок ДНК . Такие неполадки эукариоты способны устранять, но механизмы репарации недостаточно ясны. Известно, что у почкующихся дрожжей S.cerevisiae она зависит от ферментных систем, обеспечивающих, например, удаление тиминовых димеров (о чем уже было сказано), и от рекомбинации. Эта же ферментная система из семи белков (ХРА-XPG) работает, как мы уже отмечали, и при исправлении человеческой ДНК со сшитыми цепочками. Только происходит все еще сложнее. Вспомним: один из белков, XPF, разрезает цепь ДНК с 5ў -стороны от повреждения на расстоянии 20(±5) нуклеотидов, другой, XPG, - с 3ў -стороны через 6(±3) нуклеотидов от димера. Однако в ДНК человека эти эндонуклеазы вырезают 22-28 нуклеотидов в одной цепи ДНК и лишь с одной стороны от сшивки, не затрагивая сам дефект. Почему же человеческая нуклеаза не разрезает цепь обычным образом, с обеих сторон от повреждения? Потому, полагают исследователи, что перед разрезанием двойная спираль должна быть расплетена (для этого служит фермент геликаза). Но расплести дуплекс она может не по соседству со сшивкой, а на отдалении от нее - на расстоянии 20(±5) нуклеотидов с 5ў -стороны. Расплетенный участок приобретает вид пузыря. Тогда-то одна эндонуклеаза, XPG, рвет цепь на положенном ей месте (т.е. ближе к дефекту), а другая, XPF, - приблизительно 27-ю фосфодиэфирную связь с 5ў -стороны от сшивки . Но это всего лишь первый этап репарации ДНК с межцепочечными сшивками.
Что же дальше? По одной из разработанных гипотетических моделей, дальше следует рекомбинация гомологичного дуплекса ДНК. Именно большая брешь в 22-28 нуклеотидов инициирует этот процесс. Но на стадии переноса цепи он блокируется, после чего специфическая эндонуклеаза разрезает ту же нить с другой стороны сшивки. Вновь образовавшийся интермедиат узнают компоненты “молекулярных ножниц” (системы эксцизионной репарации), и осуществляется второй раунд разрезания, теперь уже двойного, во второй нити. В результате высвобождаются сшитые олигомеры, и рекомбинация завершается. Таким образом, одна цепь оказывается репарированной рекомбинацией. Брешь во второй цепи застраивается ДНК-полимеразой с использованием первой в качестве матрицы.
Интересно отметить, что недавно у высших эукариот обнаружен белок, содержащий домены геликазы и ДНК-полимеразы. Мутации его гена значительно повышают чувствительность организма к агентам, вызывающим сшивки между цепочками ДНК. А поскольку и геликазная, и полимеразная активности необходимы на определенных этапах восстановления сшитой ДНК за счет рекомбинации, был сделан вывод об участии этого белка в таком репарационном процессе. Впоследствии уникальный белок назвали ДНК-полимеразой q.
| Гипотетическая схема устранения
межцепочечных сшивок ДНК.
Объяснения в тексте. |
Если повреждение не удалено
Итак, повреждения ДНК у эукариот бывают разнообразными. И хотя существуют эффективные механизмы устранения таких дефектов, иногда клетка не способна удалить их все до единого по тем или иным причинам. В этом случае на поврежденных участках матрицы репликация ДНК останавливается. До недавнего времени было непонятно, каким же образом осуществляется копирование ДНК на поврежденных участках, не устраняемых известными способами. Это выяснилось совсем недавно.
В последние несколько лет открыта новая группа ДНК-полимераз - z, h, k, i, m, REV1, - которая как раз и предназначена для избавления от подобных повреждений . Полимеразы z, h и m осуществляют ресинтез ДНК, если в ней оказались неустраненными циклобутановые димеры между соседними тиминами; два последние фермента, а также полимеразы k и REV1 - при сохранении окисленного гуанина и апуриновых сайтов, а полимераза REV1 успешно застраивает еще и места с О(6)-метилгуанином. Интересно, что z -полимераза “работает в паре” с полимеразой h или REV1, продлевая на несколько нуклеотидов пройденный ими поврежденный участок ДНК.
Перечисленные полимеразы во время репликации ДНК иногда встраивают правильные нуклеотиды против поврежденных участков матрицы, при этом структура ДНК не нарушается. В некоторых же случаях включаются ошибочные нуклеотиды, и тогда возникают мутации. В настоящее время новой группе ДНК-полимераз уделяется особое внимание, так как клеткам необходим энзиматический аппарат, способный синтезировать ДНК в ситуациях, когда репарация вырезанием неэффективна или невозможна, а риск накопления мутаций оправдан.
* * * Первоначально механизм, предназначенный для устранения повреждений в ДНК, видимо, возник вместе с клеткой. По мере эволюции организмов он усложнялся, появлялись новые варианты. Насколько важен такой механизм, можно судить по тому, что в устранении поломок ДНК задействовано несколько десятков генов, и на производство ферментов репарации клетка тратит большую часть своих ресурсов. Надежность сохранения нуклеотидных последовательностей ДНК у высших эукариот очень велика: например, в геноме млекопитающего, насчитывающем около 3 млрд пар оснований, в клетках зародышевого пути за год подвергаются заменам лишь 10-20 оснований, а ведь повреждаются тысячи нуклеотидов. Особой надежности требует эмбриональный период: когда клетки активно делятся, необходимо как можно быстрее починить многочисленные поломки и сохранить генетическую информацию неповрежденной. Системы, благодаря которым восстанавливается природная структура ДНК, не только защищают геном от всевозможных повреждений, но и обслуживают генетические процессы в клетке. И если по какой-либо причине нарушен сам процесс репарации, это может обернуться серьезными неприятностями для клеток и всего организма. Так возникают повышенная предрасположенность к тем или иным заболеваниям, вплоть до онкологических, и тяжелые наследственные болезни. Знание механизмов, приводящих к различным заболеваниям, крайне необходимо практической медицине, чтобы облегчить поиск путей их лечения. И уж конечно, знание устраняет очередной пробел в постижении мира, будь он даже молекулярным.
Работа поддержана Российским
фондом фундаментальных исследований. Проекты 00-04-49183, 03-04-49127.
Литература
1. Sharova N.P., Abramova E.B., Dmitrieva S.B., et
al.
// FEBS Lett. 2000. V.486. P.14-18. 2. Sancar A.
// Annu. Rev. Biochem. 1996. V.65.
P.43-81. 3. Wood R.D., Shivji M.K.K.
// Carcinogenesis.
1997. V.18. P.605-610. 4. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов В.Л.
//
Мол. биология. 2002. Т.36. С.761-776. 5. Sekelsky J.J., Burtis K.C., Hawley R.S.
//
Genetics. 1998. V.148. P.1587-1598. 6. Holmes A.M., and Haber J.E.
// Cell. 1999.
V.96. P.415-424. 7. Haber J.E.
// Trends Genet. 2000. V.16. P.259-264. 8. Kohn K.W.
// Cancer Res. 1996. V.56. P.5533-5546. 9. Besshno T., Mu D., and Sancar A.
// Mol. Cell.
Biol. 1997. V.17. P.6822-6830. 10. Burgers P.M.J., Koonin E.V., Bruford E., et
al.
// J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.43487-43490.
Рис. 3.14. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК:
I-включение в цепь ДНК нуклеотида с измененной (таутомерной) формой цитоэина, который «незаконно» спаривается с аденином; II - быстрый переход цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3"-ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему ее удлинению под действием ДНК-полимеразы; III - ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3 "-ОН-конец; IV - ДНК-полимераза продолжает наращивание цепи на 3"-ОН-конце
Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельнымирепликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание.
Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность (рис. 3.15).
Рис. 3.15. Схема эксцизионной, дорепликативной репарации ДНК
При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими -пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. (см. разд. 3.4.2.3).
Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК.
В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.
Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации.
Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи (рис. 3.16). Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами (рис. 3.17).
Рис. 3.16. Схема пострепликативной репарации ДНК:
I - возникновение тиминового димера в одной из цепей ДНК;
II - образование «бреши» во вновь синтезируемой цепи против измененного участка материнской молекулы после репликации (стрелкой показано последующее заполнение «бреши» участком из соответствующей цепи второй дочерней молекулы ДНК);
III - восстановление целостности дочерней цепи верхней молекулы за счет рекомбинации и в нижней молекуле за счет синтеза на комплементарной цепи
Рис. 3.17. Межхроматидные обмены (указаны стрелками)
В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.
Под действием алкилирующих агентов, например N-метил-гТГ-нитрозомочевины или Ч^гЧ-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образуются О 6 -метил - или О 6 -алкилзамещенные гуаниновые остатки. Такие модифицированные остатки гуанина могут деалкилироваться при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и млекопитающих. О 6 -метилгуанин-ДНК-алкилтрансфераза катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Содержание алкилтрансферазы в клетках Е. coli увеличивается в присутствии О 6 -алкилгуанина, но в клетках млекопитающих аналогичной индуцибельности не наблюдается.
При облучении ДНК ультрафиолетовым светом в ней образуются циклобутановые димеры между соседними пиримидиновыми основаниями. Такие соединения блокируют репликацию ДНК, и для сохранения жизнеспособности клетки их необходимо удалить. Один из способов удаления пиримидиновых димеров состоит в ферментативном превращении их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Такие фотореактивирующие ферменты имеются у бактерий и низших эукариотических организмов, но в клетках млекопитающих они не обнаружены. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и, используя энергию поглощенного им света, разрушает димер без разрыва цепей ДНК.
б. Репарация путем замены модифицированных остатков
Замена модифицированного нуклеотида обычно происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Во-вторых, экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь. В-третьих, удаленный участок синтезируется заново с 3-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи. В-четвертых, концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи.
Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация, выщепляются ферментами, называемыми АР-эндонуклеазами. В клетках про - и эукари - от имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз, часто по нескольку разных типов. Некоторые АР-эндонуклеазы надрезают цепь с 3"-стороны АР-сайта, а другие расщепляют диэфирную связь с 3"-сто-роны; в любом случае образуются 3"-гидроксильный и 5"-фосфорильный концы. Разрыв фосфодиэфирной связи по одну или другую сторону от места нарушения позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны сайта расщепления и затем ресинтезировать удаленную последовательность.
В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют специфические N-гликозилазы - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между модифицированными основаниями и дезоксирибозой. N-гликозилазы используются и при коррекции нарушений, состоящих в спонтанном дезамини-ровании цитозина или аденина и превращении их соответственно в урацил или гипоксантин. Ферменты урацил-гликозилаза и гипоксантин-гликозилаза выщепляют из ДНК соответственно урацил и гипоксантин, оставляя пробелы в месте выщепления. И вновь с помощью механизма выщепления-ресинтеза восстанавливается исходная последовательность поврежденной цепи.
Урацил-гликозилаза играет очень важную антимутагенную роль и при исправлении ошибок, происходящих при использовании во время репликации dUTP вместо dTTP. Поскольку спаривание dUMP с матрицей происходит почти так же хорошо, как и dTMP, Pol III его не распознает, и если dUMP не подвергается специфическому выщеплению, то при последующем раунде репликации в новую цепь может включиться dGMP. Таким образом, г-гликозилаза защищает клетки от возможных мутагенных последствий включения в цепь ДНК dUMP.
Репарация тиминовых димеров может происходить и в темноте одним из следующих двух способов. В клетках Е. coli синтезируются три полипептида, кодируемые генами uvrA, uvrB и uvrC, которые образуют ферментный комплекс uvrЛВC-эндонуклеазу. Этот фермент разрезает цепь ДНК, содержащую пиримидиновый димер, на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5"-стороны и четырех или пяти связей с 3"-стороны пиримидинового димера. Удаление поврежденного участка, по-видимому, катализируется геликазой, кодируемой еще одним геном, uvrD. В результате удаляется тиминовый димер и еще примерно 12 окружающих его нуклеотидов. Образовавшийся пробел заполняется с помощью Pol I, а ДНК-лигаза завершает репарацию, соединяя два соседних основания цепи. Некоторые организмы используют для репарации повреждений, возникающих при образовании пиримидиновых димеров, другой механизм. Репарация осуществляется при участии пиримидиновый димер-г-гликозилазы, которая создает апиримидиновый сайт. Гликозидная связь между одним из тиминов и дезоксирибозой разрезается так, что тиминовый димер остается на 5"-конце разорванной цепи, а 3"-ОН-группа - на дезоксирибозе. Образовавшийся 3"-АР-конец отщепляется с помощью 3"-5"-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а затем путем ник-трансляции и лигирования удаляется нуклеотид вместе с прилежащим тиминовым димером, заполняется образовавшийся пробел и сшиваются концы цепи.
в. Значение репарации ДНК
У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации или рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, а том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клетки Е. coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительны к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток Е. coli, дефектных по Pol I, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.
У представителя низших эукариот Saccharomyces cerevisiae имеется по крайней мере пять генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих пяти RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно, и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.
Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к ультрафиолетовому свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.