Явления электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) широко используются в современной физике, химии, биологии и медицине при исследовании процессов, протекающих с участием парамагнитных молекул и ядер. Кроме того, ядерный магнитный резонанс является физической основой наиболее мощного современного метода получения изображений органов и тканей человека - магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Метод ЭПР приобрел большое значение в химии и биологии прежде всего благодаря способности обнаруживать и идентифицировать свободные радикалы в химических и биологических системах. При этом с высокой точностью определяются не только вид и концентрация свободных радикалов, но и кинетика биохимических реакций, протекающих с образованием свободных радикалов как в промежуточных, так и в конечных стадиях реакции.

Свободные радикалы в биологических системах

Известно, что в соответствии с принципом Паули в каждом квантовом состоянии молекулы может находиться не более двух электронов, спины которых должны быть противоположно ориентированы (скомпенсированы). Спин - это внутреннее свойство электрона, которое проявляется в наличии у него собственного механического момента J , т.е. электрон представляет собой как бы «закрученный» волчок. Для устойчивых молекул обычно характерно четное число электронов и каждая пара электронов на любом энергетическом уровне имеет противоположно направленные, или, как говорят, скомпенсированные (спаренные) спины.

Однако есть соединения, у которых число электронов нечетное и тогда у одного из валентных электронов спин не будет скомпенсирован. Такая же ситуация возникает и в том случае, если у стабильного соединения отнять либо, наоборот, добавить ему один электрон. Тогда спин одного из электронов тоже будет не скомпенсирован.

Молекула или ее часть, имеющая неспаренный электрон, называется свободным радикалом.

С точки зрения химии наличие в молекуле неспаренного электрона есть не что иное, как наличие у нее свободной валентности. Поэтому свободные радикалы очень активны в химическом отношении. Они легко вступают в химические связи с другими молекулами и химическими соединениями, что влияет на протекание многих процессов в биологических системах.

Наиболее важную роль в биологических системах играют следующие виды радикалов (радикал часто обозначается точкой над соответствующей химической группой):

• свободные радикалы воды: ОН - гидроксильный, Н0 2 - перекисный, 0 2 - супероксид;
• свободные радикалы органических молекул, образующиеся при действии ионизирующей и ультрафиолетовой радиации:

где е“ - сольватированный электрон, а образующийся радикал обозначен точкой сверху.

Эти свободные радикалы играют важную роль в возникновении радиационного повреждения тканей и органов, а также при УФ-ожогах;

• свободные радикалы хинонов участвуют в окислительновосстановительных реакциях организма;
• свободные радикалы липидов могут образовываться в определенных условиях при окислении их жирных кислот. Наличие свободных радикалов в липидах биологических мембран ведет к нарушению их проницаемости для ионов и других молекул, что приводит к развитию той или иной патологии в организме. Примером таких патологий может служить развитие УФ-эритемы кожи, световых ожогов глаз и др.

Основное физическое отличие свободных радикалов от других молекул состоит в том, что свободные радикалы парамагнитны, т.е. обладают собственным магнитным моментом, тогда как стабильные молекулы его не имеют, т.е. они диамагнитны. Именно это различие в магнитных свойствах и позволяет обнаруживать свободные радикалы среди диамагнитных молекул.

Основным физическим методом изучения свободных радикалов в биологических системах является электронный парамагнитный резонанс (ЭПР). Метод ЭПР получил большое распространение в биологии и медицине именно благодаря его способности определять наличие и вид свободных радикалов в биологических системах in vivo, исследовать кинетику биохимических реакций с их участием и др.

При этом очень важно, что метод этот неинвазивный, безвредный и позволяет исследовать процессы, протекающие в живых организмах, не внося никаких изменений в эти процессы.

2.3. Изучение кинетики полимеризации

2.4. Определение и изучение межмолекулярных и внутримолекулярных водородных связей

2.5. Определение степени кристалличности полимеров

2.7. Заключение

Глава 3. Метод ядерного магнитного резонанса

3.1. Основы метода

3.2. Области применения ЯМР-спектроскопии в макромолекулярной химии

3.3. Примеры применения метода ЯМР

Определение структуры вещества

Определение молекулярной массы полимера

Изучение процессов комплексообразования

О возможности определения стереорегулярности полимеров

Определение состава сополимера

Корреляция химических сдвигов винильных соединений с их параметрами и индексами реакционной способности

3.4. Заключение

Глава 4. Рентгеновская спектроскопия

4.1. Общие положения

4.2. Примеры применения рентгеноструктурного анализа

4.3. Определение степени кристалличности полимеров

4.4. Заключение

Глава 5. Полярографический метод в химии полимеров

5.1. Общие положения

5.2. Области применения полярографии в химии полимеров

5.3. Качественная идентификация полимеров

5.4. Контроль синтеза макромолекул

5.7. Заключение

Глава 6. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса

6.1. Краткие основы метода

6.3. Исследование структуры радикалов и молекулярных движений

6.4. Исследование химических процессов в полимерах

3.5. Заключение

Глава 7. Флуоресценция полимеров

7.1. Суть метода

7.2. Области применения флуоресценции

7.3. Флуоресценция полимеров

7.4. Различение полимеров и добавок

7.5. Определение молекулярной массы

7.6. Заключение

Глава 8. Масс-спектрометрия полимеров

8.1. Общие положения

8.3. Масс-спектры карбазолов

8.4. Заключение

Глава 9. Диэлектрические методы исследования строения полимеров

9.1. Термины и их определение

9.2. Зависимость диэлектрических свойств от строения полимерных материалов

9.3. Диэлектрические свойства поливинилкарбазолов

9.4. Электрофотографический метод

9.5. Фоточувствительные свойства поливинилкарбазола

9.6. Заключение

Глава 10. Хроматографические методы в химии полимеров

10.1. Общие положения

10.2. Гель-проникающая хроматография.

10.3. Тонкослойная хроматография полимеров

10.4. Пиролитическая газовая хроматография

10.5. Заключение

Глава 11. Определение некоторых параметров полимеризации

11.1. Методы определения скорости полимеризации

11.2. Расчет состава сополимеров

11.3. Заключение

Глава 12. Методы термического анализа полимерных материалов

12.1. Термогравиметрический метод

12.3. Заключение

Глава 13. Методы определения физических состояний полимеров

13.1. Термомеханический метод

13.2. Частотно-температурный метод определения физических состояний аморфных линейных полимеров

13.4. Заключение

Глава 14. Методы измерения внутреннего трения

14.1. Способы измерения внутреннего трения

14.2. Терморелаксационные кривые полимеров

14.3. Заключение

Глава 15. Методы измерения акустических характеристик полимеров

15.1. Методы измерения акустических характеристик

15.2. Области применения

15.3. Заключение

Глава 16. Методы определения вязкости расплавов и растворов полимеров

16.1. Капиллярная вискозиметрия

16.2. Ротационная вискозиметрия

16.3. Измерения вязкости разбавленных растворов полимеров

16.4. Заключение

Глава 17. Методы определения молекулярной массы и молекулярно-массового распределения полимеров

17.1. Методы определения молекулярных масс полимеров

17.2. Определение молекулярной массы по концевым группам

17.3. Методы определения молекулярно-массового распределения полимеров

17.4.Области применения ММР в исследовательской практике

17.5. Влияние конверсии мономера на ММР

17.6. Температура полимеризации и ее связь с молекулярной массой.

17.7. Вязкость расплавов полимеров

17.8. Заключение

Глава 18. Механические свойства полимерных материалов и методы их определения

18.1. Области применения механических свойств

18.2. Методы определения важнейших механических показателей полимерных материалов

18.3. Заключение

Список литературы

Глава 6. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса

6.1. Краткие основы метода

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса(ЭПР) – это явление резонансного поглощения энергии электромагнитных волн парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле. Это поглощение возникает вследствие того, что неспаренные

электроны парамагнитных частиц ориентируются в постоянном магнитном поле так, что их собственный момент количества движения (спин) направлен либо по полю, либо против поля. Поглощение представляет собой функцию неспаренных электронов, содержащихся в

исследуемом		Вследствие		поглощения
высокочастотного поля образцом появляется сигнал ЭПР. Спектр ЭПР
представляет собой зависимость поглощения микроволновой энергии от
внешнего	магнитного			Поглощениепля
сверхвысокочастотного магнитного поля регистрируется либо на экране
осциллографа, либо на самописце радиоспектрометра.
	рис. 6.1 приведена					ЭПР-спектре

гипотетического соединения.

радикала. Для этих целей составлены атласы спектров ЭПР различных соединений. Для интерпретации спектров ЭПР важны следующие параметры линий: форма, интенсивность, положение и расщепление.

Следует заметить, что приборы сразу же выдают первую производную кривой поглощения энергии (рис. 6.1).

Интенсивность линии ЭПР-спектра – это площадь под его кривой. Она пропорциональна числу неспаренных электронов в образце. За положение линии в спектре ЭПР принимается точка, в которой первая

~O -CH -O ~

Рис. 6.2. Схема появления сверхтонкого расщепления в ЭПР-спектре срединного радикала полиформальдегида

	когда система	содержит ядра с магнитным моментом,
например протон (Н1 ), вблизи неспаренного электрона, на магнитный
момент электрона влияет ориентация магнитного момента. ядраВ
результате такого взаимодействия каждый магнитный энергетический
	электрона	расщепляется				ПодуровнейЭто
взаимодействие электрона и магнитного ядра называется сверхтонким
взаимодействием (СТВ), а		расщепление		энергетических		уровней–
сверхтонким расщеплением (рис. 6.2).
6.2. Области применения ЭПР-спектроскопии в
макромолекулярной химии
ЭПР-спектроскопия			макромолекулярной

используется для изучения свободных радикалов, образующихся в следующих процессах:

· полимеризации (фото-, радиационное инициирование и т. д.);

· деструкции полимеров;

· окисление полимеров;

· расщепление макромолекул при механодеструкции.

6.3. Исследование структуры радикалов и молекулярных движений

Энергия СТВ неспаренного электрона с ядрами складывается из двух частей – изотропной и анизотропной. Так, изотропная часть определяет энергию дипольного взаимодействия электрона с ядром, и она зависит от угла между осьюр -орбитали неспаренного электрона и направлением постоянного магнитного поля. Анизотропное СТВ проявляется в спектре ЭПР радикалов в твердых телах, где ориентация радикалов жестко фиксированы. В жидкостях анизотропное СТВ отсутствует.

полиэтилена -CH 2 - CH - CH 2 - CH - (рис. 6.3).

В поликристаллическом полимере спектр состоит из шести линий

(рис. 6.3, а ). Это	обусловлено тем, что		взаимодействие		неспаренного
электрона	осуществляется
магнитноэквивалентными		протонами,			константы
примерно одинаковы.

Рис. 6.3. Спектры ЭПР срединного радикала полиэтилена в поликристалле (а ) и в монокристалле при ориентации оси макромолекулы вдоль поля (б ) и перпендикулярно полю (в )

Однако спектр полиэтилена ориентированного, в котором зигзаг цепи полимера расположен вдоль направления поля, уже имеет пять линий (рис. 6.3, б ). Этот ЭПР-спектр обусловлен взаимодействием неспаренного электрона только с четырьмя протонами. Взаимодействие с α-водородом в этой ориентации мало и не проявляется в спектре.

Если теперь повернуть поле и направить его вдольр -орбитали, перпендикулярно зигзагу цепи, то появляются 10 линий (рис. 6.3, в ). Удвоение числа линий связано с расщеплением на α-протоне, которое при этой ориентации достаточно велико.

Рис. 6.4. Спектры ЭПР срединного ~CH2 - C H - CH2 ~ (а ) и концевого

~CH2 - C H2 (б ) макрорадикалов полиэтилена

В полиэтилене цепи имеют плоскую конформацию, и поэтому в срединном радикале все пять протонов, ближайших к реакционному центру радикала, магнитно эквивалентны. Спектр ЭПР такого радикала (рис. 6.4, а ) состоит из шести линий, распределение интенсивностей которых описывается биномиальным законом. Спектр ЭПР концевого радикала состоит из пяти линий (рис. 6.4, б ).

6.4. Исследование химических процессов в полимерах

Метод ЭПР используется для обнаружения, радикалов исследования их превращений и радикальных реакций в полимерах.

Для исследования химических процессов важно не только идентифицировать радикалы, но и измерить их концентрации. Прямое определение свободных радикалов с помощью ЭПР в ходе свободнорадикальной полимеризации в настоящее время не совсем успешно. Это обусловлено тем, что при обычных экспериментальных скоростях полимеризации концентрация радикалов очень мала.

Методом ЭПР идентифицированы растущие макрорадикалы в жидкой и твердой фазах, определены их концентрации, найдены константы скорости роста и обрыва цепей.

Метод ЭПР приобрел большое значение в химии, физике, биологии, медицине, поскольку позволяет определять структуры и концентрации органических и неорганических свободных радикалов. Свободные радикалы могут быть созданы химическим методом, фотохимически или при действии излучения высокой энергии.

Спектр ЭПР дают свободные радикалы, молекулы с нечетным числом электронов, триплетные состояния органических молекул, парамагнитные ионы переходных металлов и их комплексы.

Метод ЭПР начал применятся в биологических исследованиях в 50-ые годы 20 в. Благодаря довольно высокой чувствительности и возможности в определении природы парамагнитных частиц этот метод нашел широкое применение для изучения целого ряда биологических процессов.

Помимо сигналов свободных радикалов в тканях наблюдается целый ряд сигналов металлов (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Эти металлы входят в состав металлопротеинов, принимающих участие в целом ряде ферментативных процессов. Железосодержащие белки (цитохромы, ферредоксины) являются компонентами электрон-транспортных цепей в митохондриях и хлоропластах.

Методом ЭПР исследован целый ряд ферментативных систем, обнаружены свободно-радикальные продукты субстратов. В ряде случаев оказалось возможным наблюдать за окислительно-восстановительными превращениями ионов металлов, входящих в активный центр фермента.

ЭПР-спектроскопия широко применяется в исследованиях фотосинтеза: изучается механизм первичных стадий разделения зарядов в реакционных центрах и дальнейший перенос электрона по цепи электронного транспорта.

Помимо изучения механизмов реакций, протекающих с участием парамагнитных частиц, метод ЭПР широко используют и для исследования структурно-динамических свойств макромолекул и биомембран.

В последнее время для изучения биологических и полимерных систем часто используются методы «парамагнитного зонда», «спиновых меток» и «спиновых ловушек». Все они основаны на использовании стабильных азотнокислых радикалов различного строения, а точнее на анализе изменений ширины линий спектров ЭПР, вызванных вращательной и поступательной диффузией этих радикалов.

Основная идея метода спиновых меток и зондов состоит в присоединении к той или иной функциональной группе белка свободного радикала и изучению характеристик его сигналов ЭПР. Наиболее удобны в этом отношении нитроксильные радикалы, содержащие свободнорадикальную группу:

где R 1 и R 2 – различные химические группировки.

Метод «спиновых меток» заключается в том, что к непарамагнитной молекуле стабильный радикал прикрепляется ковалентной или какой-либо другой связью так, чтобы свободная валентность оказалась незатронутой. Характер движения отчетливо проявляется в форме спектра и служит важным источником информации об исходной молекуле.

Если молекула встраивается в белковую молекулу и там удерживается с помощью электростатических сил или гидрофобных взаимодействий, то такая молекула называется спиновым зондом. Метод основан на исследовании вращательной и поступательной подвижности радикала-зонда в водных или органических средах или в матрице полимера. Подвижность радикала зависит от подвижности молекул окружающей среды, поэтому радикал является своеобразным молекулярным датчиком структурной и динамической информации о локальном окружении.

Форма сигнала ЭПР, даваемого спиновой меткой или зондом, зависит от микроокружения нитроксильного радикала и, в первую очередь, от вращательной подвижности той группы, в состав которой он входит.

Основной недостаток спиновых меток и зондов заключается в том, что хотя эти молекулы и невелики, всё же, включаясь в липидный бислой, они несколько изменяют его свойства.

В основе метода «спиновых ловушек» лежит реакция специально вводимой в исследуемую систему непарамагнитной молекулы (ловушки) с короткоживущим радикалом, при этом образуется стабильный радикал. Кинетическое поведение образующегося стабильного радикала и его структура дают сведения о кинетике и механизме процессов в изучаемой системе.

Объектами исследования в химии с применением ЭПР-спектроскопии являются: 1) свободные радикалы в промежуточных продуктах органических реакций; 2) кинетика реакций; 3) химия поверхностных явлений; 4) разрушение, происходящее в результате облучения; 5) полимеризация, обусловленная свободными радикалами; 6) свободные радикалы, замороженные при низких температурах; 7) металлы переменной валентности и их комплексы.

Метод ЭПР дает ценный вклад в исследование кинетики и механизмов химических реакций. Во-первых, измерение ширины линий в спектрах ЭПР можно использовать для определения констант скорости процессов с участием парамагнитных частиц, характеристическое время жизни которых лежит в интервале 10 -5 -10 -10 с. Во-вторых, метод ЭПР позволяет регистрировать с высокой чувствительностью в разных условиях парамагнитные частицы, что дает ценную информацию о механизмах реакций. В-третьих, спектрометр ЭПР можно использовать как аналитический прибор для детектирования в ходе реакций концентрации реагирующих парамагнитных молекул. Количество парамагнитных центров в образце пропорционально площади под спектром поглощения.

Метод ЭПР широко используется для исследования быстрых процессов, связанных с изменением молекулярной структуры радикалов. Эти процессы включают заторможенное вращение и конформационные переходы.

Для короткоживущих радикалов чувствительность метода может быть повышена путем использования проточной системы или непрерывного облучения. Спектры ЭПР нестабильных радикалов можно получить, зафиксировав их в стеклах, матрицах замороженных благородных газов или кристаллах.

Вопросы для собеседования

1. Теоретические основы метода.

2. Аналитические параметры ЭПР-спектра.

3. Спектрометры ЭПР.

4. Применение ЭПР.

Тестовые задания

1. Условие резонанса в методе ЭПР:

а) n= gH 0 (1-s) / 2p; б) δ = (ΔН/Н 0);·в)hn=gβH 0 ; г) δ = (Δν/ν 0)/(ΔН/Н 0).

2. Что происходит в момент резонанса в методе ЭПР:

а) происходит поглощение квантов излучения, переориентации спинов не происходит;

б) происходит поглощение квантов излучения и переориентации спинов, т.е. переход из нижнего энергетического состояния в верхнее и наоборот. Количество переходов снизу вверх больше числа переходов сверху вниз.

в) происходит поглощение квантов излучения и переориентации спинов, т.е. переход из нижнего энергетического состояния в верхнее и наоборот. Количество переходов сверху вниз больше числа переходов снизу вверх.

3. Параметры спектров ЭПР:

а) g-фактор, ширина полосы поглощения, интенсивность линии поглощения;

б) общее число сигналов, интенсивность сигналов, химический сдвиг, мультиплетность сигнала;

в) g-фактор, ширина полосы поглощения, интенсивность линии поглощения, СТС спектров ЭПР.

МАСС-СПЕКРОМЕТРИЯ

Данный метод принципиально отличается от спектроскопических методов. Методы масс-спектрометрии основаны на ионизации вещества, разделении ионов, согласно отношению (m/z ), и регистрации массы образующихся осколков.

Теоретические и экспериментальные основы масс-спектрометрии были заложены еще Д.Д. Томсоном, который впервые в 1912 г. создал прибор для получения масс-спектра положительных ионов. Однако его прибор имел низкое разрешение. Его ученик Ф. Астон в 1918 г. существенно повысил разрешение и на своем приборе впервые открыл изотопы элементов. Практически одновременно с Ф. Астоном в Чикаго А. Демпстер сконструирован первый масс-спектрометр, в котором анализатором служило поперечное магнитное поле, а ионные токи измерялись электрическими методами. Схема его используется и в современных приборах.

Ионизация молекул должна проводиться в таких условиях, при которых образовавшийся ион вне зависимости от метода ионизации не претерпевал бы никаких столкновений с другими молекулами или ионами. Это необходимо для установления взаимосвязи между свойствами иона и молекулы.

Методы ионизации

Ионизация может проводиться различными методами.

1. Метод ионизации электронным ударом (ЭУ).

Это наиболее распространенный метод получения ионов в связи с простотой и доступностью источников ионов и их высокой эффективностью. Допустим, что через пары вещества проходит поток электронов, энергию которых можно постепенно увеличивать. Если эта энергия достигнет определенного уровня, то при столкновении электрона с молекулой может произойти «выбивание» из нее электрона с образованием молекулярного иона:

многоатомная молекула молекулярный ион (катион-радикал)

Наименьшая энергия бомбардирующих электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией ионизации вещества. Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее связанный с ней электрон. Для органических молекул энергия ионизации составляет 9 ÷12 эВ.

Если энергия электронов значительно превышает энергию ионизации, то образующийся молекулярный ион получает избыточную энергию, которой может оказаться достаточно для разрыва в нем связей. Происходит распад молекулярного иона на частицы меньшей массы (фрагменты). Такой процесс называется фрагментацией . В практике масс-спектрометрии используются электроны с энергией 30÷100 эВ, что обеспечивает фрагментацию молекулярного иона.

Молекулярные ионы - это такие ионы, массы которых равны массе ионизируемой молекулы. К сожалению, нет прямых методов определения структуры ионов. Поэтому часто используют предположение о тождественности структуры молекулярного иона (М +) и нейтральной молекулы (М). Вероятность образования молекулярного иона больше для простых, малых молекул. С увеличением числа атомов в молекуле увеличивается вероятность фрагментации молекулярного иона.

Известны два основных типа фрагментации молекулярного иона - диссоциация и перегруппировка.

Диссоциация - распад молекулярного иона с сохранением последовательности связей. В результате процесса образуются катион и радикал:

Диссоциация углеводородов приводит к фрагментам с нечетными значениями отношения m/z.

Перегруппировка сопровождается изменением последовательности связей, в результате чего образуется новый катион-радикал меньшей массы и нейтральная устойчивая молекула (Н 2 О, СО, СО 2 и т.д.):

Перегруппировка углеводородов и кислородсодержащих соединений приводит к фрагменту с четным значением отношения m/z. Измерение массы образующихся осколков и их относительного количества позволяет получить ценную информацию о строении органических соединений.

Рассмотрим устройство масс-спектрометра (рис. 1). Масс-спектрометр должен содержать узлы для выполнения следующих функций: 1) ионизации пробы, 2) ускорение ионов электрическим полем, 3) распределение ионов согласно отношению m/z, 4) детектирование ионов по соответствующему электрическому сигналу.

Рис.1. Устройство масс-спектрометра

1 - источник электронов; 2 - ионизационная камера; 3 - ускорительные пластины (отрицательный потенциал); 4 - магнит; 5 - щель;

6 - коллектор ионов (детектор ионов)

Для получения масс-спектра пары вещества небольшими количествами с помощью специальной системы напуска вводятся в ионизационную камеру (2) , где поддерживается глубокий вакуум (давление 10 -6 мм рт. ст.). Молекулы вещества бомбардируются потоком электронов, излучаемых раскаленным катодом (1). Образующиеся ионы выталкиваются из ионизационной камеры небольшой разностью потенциалов (3). Получаемый поток ионов ускоряется, фокусируется сильным электрическим полем и попадает в магнитное поле (4).

В результате бомбардировки молекул вещества электронами образуются частицы, имеющие положительный или отрицательный заряд, а также нейтральные частицы. При прохождении потока частиц через магнитное поле нейтральные частицы не изменяют направления, а положительные и отрицательные отклоняются в разные стороны. Величины отклонения ионов пропорциональны заряду и обратно пропорциональны их массе.

Каждый отдельный ион, характеризуемый конкретной величиной m/z, при данной напряженности магнитного поля движется по собственной траектории. Интервал сканирования масс можно изменять, варьируя либо напряженностью магнитного поля, либо потенциалом электрического поля.

В обычной масс-спектрометрии принято регистрировать только частицы, имеющие положительный заряд, т.к. при бомбардировке молекул электронами положительно заряженных ионов обычно больше, чем отрицательно заряженных. Если необходимо изучать и отрицательно заряженные ионы, следует изменить знак потенциала ускорения (ускорительные пластины).

Если на выходе ионов из магнитного поля установить регистрирующее устройство, то частицы, различающиеся значениями m/z, будут давать раздельные сигналы. Интенсивность сигналов будет пропорциональна количеству частиц с данным значением m/z. Интенсивность сигналов определяется как их высота, выраженная в мм. Высота пика с максимальной интенсивностью принимается за 100 % (базовый пик), интенсивность остальных пиков пересчитывается пропорционально и выражается в процентах.

С ростом отношения m/z разница в отклонении магнитным полем частиц, различающихся на одну атомную единицу массы, уменьшается. В связи с этим важной характеристикой масс-спектрометров является их разрешающая способность (R) , определяющая максимальную массу ионов, различающихся на одну атомную единицу массы (для которой прибор разделяет пики не менее чем на 90%):

где М - максимальная масса, для которой перекрывание пиков менее 10%; ΔМ - одна атомная единица массы.

Стандартные приборы имеют R ≈ 5000/1, а для приборов с двойной фокусировкой потока ионов R ≈ 10000/1 и даже больше. Такие приборы способны уловить разницу в молекулярной массе ионов до 0,0001. Масс-спектрометр с двойной фокусировкой может легко разделить пики ионов с одинаковыми номинальными величинами молекулярных масс, но разным элементным составом. Например, может различить N 2 (28,0061), CO (27,9949), и C 2 H 4 (28,0313).

Установление эмпирической формулы по данным масс-спектров задача не простая, но ее можно решить, используя подходящий алгоритм. Для получения масс-спектра требуется ничтожно малое количество вещества - около 1 мкг.

2. Химическая ионизация (ХИ).

В этом методе образец до облучения пучком электронов разбавляют большим избытком «газа-реагента». Вероятность первичных ионизирующих столкновений между электронами и молекулами образца после этого настолько мала, что первичные ионы образуются почти исключительно из молекул реагента. В качестве реагентов обычно используют газы с низкой молекулярной массой, например, CH 4 , изо-C 4 H 10 , NH 3 и инертные газы (Ar, He). Вторичные ионы образуются в результате переноса атома водорода или электрона.

Если газом-реагентом служит метан, то реакции протекают в такой последовательности:

CH 4 + ē → CH 4 + + 2ē

CH 4 + + ē → CH 3 + + H + + 2ē

CH 4 + + CH 4 → CH 5 + + CH 3

CH 3 + + CH 4 → C 2 H 5 + + H 2

R-CH 3 + CH 5 + → R-CH 4 + + CH 4

где R-CH 3 - молекула исследуемого вещества.

Исследования показали, что частицы CH 5 + и C 2 H 5 + в сумме составляют около 90% ионов, присутствующих в этой системе. Масс-спектры, получаемые после химической ионизации, намного проще, содержат меньше пиков, и поэтому их часто легче интерпретировать.

АО «МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ АСТАНА»

Кафедра информатики и математики с курсом медбиофизики

Реферат

По медбиофизике

Тема «Использование ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) в медицинских исследованиях»

Работа выполнена студентом:

Факультет общей медицины, стоматологии и фармации

Работу проверил:

I Введение.

II Основная часть. ЭПР и ЯМР: физическая сущность и процессы, лежащие в основе этих явлений, применение в медико-биологических исследованиях.

1) Электронный парамагнитный резонанс.

а) Физическая сущность ЭПР.

б) Расщепление энергетических уровней. Эффект Зеемана.

в) Электронное расщепление. Сверхтонкое расщепление.

г) Спектрометры ЭПР: устройство и принцип работы.

д) Метод спинового зонда.

е) Применение спектров ЭПР в медико-биологических исследованиях.

2) Ядерный магнитный резонанс.

а) Физическая сущность ЯМР.

б) Спектры ЯМР.

в) Использование ЯМР в медико-биологических исследованиях: ЯМР-интроскопия (магнитно-резонансная томография).

III Заключение. Значение медицинских методов исследования, основывающихся на ЭПР и ЯМР.

I . Введение.

У атома, помещенного в магнитное поле, спонтанные переходы между подуровнями одного и того же уровня маловероятны. Однако такие переходы осуществляются индуцировано под влиянием внешнего электромагнитного поля. Необходимым условием является совпадение частоты электромагнитного поля с частотой фотона, соответствующего разности энергий между расщепленными подуровнями. При этом можно наблюдать поглощение энергии электромагнитного поля, которое называют магнитным резонансом. В зависимости от типа частиц – носителей магнитного момента – различают электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

II . Основная часть. ЭПР и ЯМР: физическая сущность и процессы, лежащие в основе этих явлений, применение в медико-биологических исследованиях.

1. Электронный парамагнитный резонанс. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), это резонансное поглощение электромагнитной энергии в сантиметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные частицы. ЭПР - один из методов радиоспектроскопии. Вещество называется парамагнитным, если оно не имеет макроскопического магнитного момента в отсутствие внешнего магнитного поля, но приобретает его после приложения поля, при этом величина момента зависит от поля, а сам момент направлен в ту же сторону, что и поле. С микроскопической точки зрения парамагнетизм вещества обусловлен тем, что атомы, ионы или молекулы, входящие в это вещество, обладают постоянными магнитными моментами, случайно ориентированными друг относительно друга в отсутствие внешнего магнитного поля. Приложение постоянного магнитного поля приводит к направленному изменению их ориентаций, вызывающему появление суммарного (макроскопического) магнитного момента.

ЭПР открыт Е. К. Завойским в 1944 году. Начиная с 1922 в ряде работ высказывались соображения о возможности существования ЭПР. Попытка экспериментально обнаружить ЭПР была предпринята в середине 30-х годов нидерландским физиком К. Гортером. Однако ЭПР удалось наблюдать только благодаря радиоспектроскопическим методам, разработанным Завойским. ЭПР - частный случай магнитного резонанса.

Физическая сущность ЭПР. Суть явления электронного парамагнитного резонанса заключается в следующем. Если поместить свободный радикал с результирующим моментом количества движения J в магнитном поле с напряжённостью B 0 , то для J, отличного от нуля, в магнитном поле снимается вырождение, и в результате взаимодействия с магнитным полем возникает 2J+1 уровней, положение которых описывается выражением: W = gβB 0 M, (где М=+J, +J-1, …-J) и определяется Зеемановским взаимодействием магнитного поля с магнитным моментом J.

Если теперь к парамагнитному центру приложить электромагнитное поле с частотой ν, поляризованное в плоскости, перпендикулярной вектору магнитного поля B 0 , то оно будет вызывать магнитные дипольные переходы, подчиняющиеся правилу отбора ΔМ=1. При совпадении энергии электронного перехода с энергией фотона электромагнитной волны будет происходить резонансное поглощение СВЧ излучения. Таким образом, условие резонанса определяются фундаментальным соотношением магнитного резонанса hν = gβB 0 .

Расщепление энергетических уровней. Эффект Зеемана. В отсутствие внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентированы случайным образом, и их энергия практически не отличается друг от друга (Е 0). При наложении внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются в поле в зависимости от величины спинового магнитного момент, и их энергетический уровень расщепляется на два. Энергия взаимодействия магнитного момента электрона с магнитным полем выражается уравнением:

, - магнитный момент электрона, Н - напряженность магнитного поля. Из уравнения коэффициента пропорциональности следует, что ,

а энергия взаимодействия электрона с внешним магнитным полем составит

.

Это уравнение описывает эффект Зеемана, который можно выразить следующими словами: энергетические уровни электронов, помещенных в магнитное поле, расщепляются в этом поле в зависимости от величины спинового магнитного момента и интенсивности магнитного поля.

Электронное расщепление. Сверхтонкое расщепление. Большинство приложений, в том числе и медико-биологических, базируются на анализе группы линий (а не только синглентых) в спектре поглощения ЭПР. Наличие в спектре ЭПР группы близких линий условно называют расщеплением. Имеется два характерных типа расщепления для спектра ЭПР. Первое – электронное расщепление – возникает в тех случаях, когда молекула или атом обладают не одним, а несколькими электронами, вызывающими ЭПР. Второе – сверхтонкое расщепление – наблюдается при взаимодействии электронов с магнитным моментом ядра. Согласно классическим представлениям, электрон, обращающийся вокруг ядра, как и любая движущаяся по круговой орбите заряженная частица, имеет дипольный магнитный момент. Аналогично и в квантовой механике, орбитальный угловой момент электрона создаёт определённый магнитный момент. Взаимодействие этого магнитного момента с магнитным моментом ядра (обусловленным ядерным спином) приводит к сверхтонкому расщеплению (т. е. создаёт сверхтонкую структуру). Однако электрон также обладает спином, дающим вклад в его магнитный момент. Поэтому сверхтонкое расщепление имеется даже для термов с нулевым орбитальным моментом. Расстояние между подуровнями сверхтонкой структуры по порядку величины в 1000 раз меньше, чем между уровнями тонкой структуры (такой порядок величины по существу обусловлен отношением массы электрона к массе ядра).

Спектрометры ЭПР: устройство и принцип работы. Устройство радиоспектрометра ЭПР во многом напоминает устройство спектрофотометра для измерения оптического поглощения в видимой и ультрафиолетовой частях спектра. Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн. Диафрагме спектрофотометра в радиоспектрометре соответствует аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектрометре находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой параллелепипед, имеющий цилиндрическую или прямоугольную полость в которой находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что в нем образуется стоячая волна. Элементом отсутствующем в оптическом спектрометре является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов. Излучение, прошедшее измеряемый образец, в радиоспектрометре и в спектрофотометре, попадает на детектор, затем сигнал детектора усиливается и регистрируется на самописце или компьютере. Следует отметить еще одно отличие радиоспектрометра. Оно заключается в том, что излучение радиодиапазона передается от источника к образцу и далее к детектору с помощью специальных трубок прямоугольного сечения, называемых волноводами. Размеры сечения волноводов определяются длиной волны передаваемого излучения. Эта особенность передачи радиоизлучения по волноводам и определяет тот факт, что для регистрации спектра ЭПР в радиоспектрометре используется постоянная частота излучения, а условие резонанса достигается изменением величины магнитного поля. Еще одной важной особенностью радиоспектрометра является усиление сигнала посредством его модуляции высокочастотным переменным полем. В результате модуляции сигнала происходит его дифференцирование и превращение линии поглощения в свою первую производную, являющуюся сигналом ЭПР.

Метод спинового зонда. Спиновые зонды - индивидуальные парамагнитные химические вещества, применяемые для изучения различных молекулярных систем с помощью спектроскопии ЭПР. Характер изменения спектра ЭПР этих соединений позволяет получать уникальную информацию о взаимодействиях и динамике макромолекул и о свойствах различных молекулярных систем. Это метод исследования молекулярной подвижности и различных структурных превращений в конденсированных средах по спектрам электронного парамагнитного резонанса стабильных радикалов (зондов), добавленных к исследуемому веществу. Если стабильные радикалы химически связаны с частицами исследуемой среды, их называют метками и говорят о методе спиновых (или парамагнитных) меток. В качестве зондов и меток используют главным образом нитроксильные радикалы, которые устойчивы в широком интервале температур (до 100-200○С), способны вступать в химические реакции без потери парамагнитных свойств, хорошо растворимы в водных и органических средах. Высокая чувствительность метода ЭПР позволяет вводить зонды (в жидком или парообразном состоянии) в малых количествах - от 0,001 до 0,01% по массе, что не вызывает изменения свойств исследуемых объектов. Метод спиновых зондов и меток применяется особенно широко для исследования синтетических полимеров и биологических объектов. При этом можно изучать общие закономерности динамики низкомолекулярных частиц в полимерах, когда спиновые зонды моделируют поведение различных добавок (пластификаторы, красители, стабилизаторы, инициаторы); получать информацию об изменении молекулярной подвижности при химической модификации и структурно-физических превращениях (старение, структурирование, пластификация, деформация); исследовать бинарные и многокомпонентные системы (сополимеры, наполненные и пластифицированные полимеры, композиты); изучать растворы полимеров, в частности влияние растворителя и температуры на их поведение; определять вращательную подвижность ферментов, структуру и пространств. расположение групп в активном центре фермента, конформацию белка при различных воздействиях, скорость ферментативного катализа; изучать мембранные препараты (например, определять микровязкость и степень упорядоченности липидов в мембране, исследовать липид-белковые взаимодействия, слияние мембран); изучать жидкокристаллические системы (степень упорядоченности в расположении молекул, фазовые переходы), ДНК, РНК, полинуклеотиды (структурные превращения под влиянием температуры и среды, взаимодействие ДНК с лигандами и интеркалирующими соединениями). Метод используют также в различных областях медицины для исследования механизма действия лекарственных препаратов, анализа изменений в клетках и тканях при различных заболеваниях, определении низких концентраций токсичных и биологически активных веществ в организме, изучения механизмов действия вирусов.

Основы электронного парамагнитного резонанса и его применение к исследованию свободных радикалов. Ядерный магнитный резонанс. Химический сдвиг. Основы ЯМР-томографии.

Магнитный резонанс

Избирательное поглощение электромагнитных волн определенной частоты веществом в постоянном магнитном поле, обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер, называют ядерным магнитным резонансом .

ЯМР можно наблюдать при выполнении условия (h  = g я  я В , где g я - ядерный множитель Ланде ) лишь для свободных атомных ядер. Экспериментальные значения резонансных частот ядер, находящихся в атомах и молекулах, не соответствуют условию. При этом происходит «химический сдвиг», который возникает в результате влияния локального (местного) магнитного поля, создаваемого внутри атома электронными токами, индуцированными внешним магнитным полем. В результате такого «диамагнитного эффекта» возникает дополнительное магнитное поле, индукция которого пропорциональна индукции внешнего магнитного поля, но противоположна ему по направлению. Поэтому полное эффективное магнитное поле, действующее на ядро, характеризуется индукцией В эф = (1   ) В , где  - постоянная экранирования, по порядку величины равная 10 -6 и зависящая от электронного окружения ядер.

Отсюда следует, что для данного типа ядер, находящихся в различных окружениях (разные молекулы или разные, не эквивалентные места одной и той же молекулы), резонанс наблюдается при различных частотах. Это и определяет химический сдвиг. Он зависит от природы химической связи, электронного строения молекул, концентрации данного вещества, типа растворителя, температуры и т. д.

Если два или несколько ядер в молекуле экранированы по-разному, т. е. ядра в молекуле занимают химически не эквивалентные положения, то они имеют различный химический сдвиг. Спектр ЯМР такой молекулы содержит столько резонансных линий, сколько химически не эквивалентных групп ядер данного типа в ней имеется. Интенсивность каждой линии пропорциональна числу ядер в данной группе.

В спектрах ЯМР различают два типа линий по их ширине. Спектры твердых тел имеют большую ширину, и эту об ласть применения ЯМР называют ЯМР широких линий. В жидкостях наблюда ют узкие линии, и это называют ЯМР высокого разрешения.

По химическому сдвигу, числу и положению спектральных линий можно установить структуру молекул.

Химики и биохимики широко используют метод ЯМР для исследования структуры от простейших молекул неорганических веществ до сложнейших молекул живых объектов. Одним из преимуществ этого ана­лиза является то, что он не разрушает объектов исследования.

Интроскопия – визуальное наблюдение предметов или процессов внутри оптических непрозрачных тел, в непрозрачных тел, в непрозрачных средах (веществах).

Достоинством метода ЯМР-томографии является его высокая чувствительность в изображении мягких тканей, а также высокая разрешающая способность, вплоть до долей миллиметра. В отличие от рентгеновской томографии ЯМР-томография позволяет получить изображение исследуемого объекта в любом сечении.

Магнитный резонанс - избирательное поглощение электромагнитных волн веществом, помещенным в магнитное поле.

В зависимости от типа частиц - носителей магнитного момента - различают электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) .

ЭПР происходит в веществах, содержащих парамагнитные частицы: молекулы, атомы, ионы, радикалы, обладающие магнитным моментом, обусловленным электронами. Возникающее при этом явление Зеемана объясняют расщеплением электронных уровней. Наиболее распространен ЭПР на частицах с чисто спиновым магнитным моментом.

У словие резонансного поглощения энергии :

Магнитный резонанс наблюдается, если на частицу одновременно действуют постоянное поле индукции В рез и электромагнитное поле с частотой . Обнаружить резонансное поглощение можно двумя путями : либо при неизменной частоте плавно изменять магнитную индукцию, либо при неизменной магнитной индукции плавно изменять частоту. Технически более удобным оказывается первый вариант.

Форма и интенсивность спектральных линий, наблюдаемых в ЭПР, определяются взаимодействием магнитных моментов электронов, в частности спиновых, друг с другом, с решеткой твердо­го тела и т. п.

При электронном парамагнитном резонансе наряду с поглощением энергии и увеличением населенности верхних подуровней происходит и обратный процесс - безызлучательные переходы на нижние подуровни, энергия частицы передается решетке.

Процесс передачи энергии частиц решетке называют спин-ре шеточной релаксацией, он характеризуется временем .

Современная методика измерения ЭПР основывается на определении изменения какого-либо параметра системы, происходящего при поглощении электромагнитной энергии.

Прибор, используемый для этой цели называют ЭПР-спектро метром. Он состоит из следующих основных частей (рис. 25.5): 1 - электромагнит, создающий сильное однородное магнитное поле, индукция которого может плавно изменяться; 2 - генератор СВЧ-излучения электромагнитного поля; 3 - специальная «поглощающая ячейка», которая концентрирует падающее СВЧ-излучение на образце и позволяет обнаружить поглощение энергии образцом (объемный резонатор); 4 - электронная схема, обеспечивающая наблюдение или запись спектровЭПР; 5 - образец; 6 - осциллограф.

В современных ЭПР-спектрометрах используют частоту около 10 ГГц

Одно из медико-биологических применений метода ЭПР заключается в обнаружении и исследовании свободных радикалов. ЭПР широко используют для изучения фотохимических процессов, в частности фотосинтеза. Исследуют канцерогенную активность некоторых веществ. С санитарно-гигиенической целью метод ЭПР используют для определения концентрации радикалов в воздушной среде.